@phdthesis{oai:konan-u.repo.nii.ac.jp:00000021,
 author = {船附, 賢三 and Funatsuki, Kenzo},
 month = {2015-03-10},
 note = {平成10年度(1998年度), application/pdf, 中村らはこれまでに、大腸菌をアクリフラビン感受性にする一群の突然変異株を報告してきた。アクリフラビン感受性を支配する染色体上の変異をacr (acriflavine-sensitive) 変異と呼び、acrA, acrB, acrC ,acrD, およびacrEの5種が同定された。今回、著者は分子生物学的手法を使って、このacrB変異の解析をおこなった。acrB変異がDNA gyrase (Gyrase)のBサブユニット(GyrB)をコードするgyrB遺伝子と同一シストロン上に位置することがHansenらによってすでに報告されている。このことから第1章において、このacrB変異の位置を知る目的で、最初にacrB変異株よりgyrB遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、acrB変異株のgyrB遺伝子は、そのコードするGyrBタンパク質のC未端部分に、2つのアミノ酸置換(Ser759-Arg760⇒Arg-Cys)の変異が存在することを明らかにした。次に、野生型gyrB遺伝子およびacrB変異型gyrB遺伝子を組み込んだプラスミドをそれぞれ作成し、大腸菌に形質転換した。そして、gyrB遺伝子上のacrB変異がアクリフラビン感受性に関与することを明らかにした。そこで、in vitroにおいてacrB変異がGyraseの酵素活性におよぼす影響を明らかにするため、Gyraseの各サブユニットの精製系を新たに構築した。グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)タンパク質融合法により、Aサブユニット(GyrA)およびGyrBサブユニットをそれぞれ大腸菌で大量に発現させた後、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて、各サブユニットを精製した。そこで、それぞれ精製したGyrAおよびGyrBサブユニットを会合させ、各種Gyrase四量体(A2B2)を再構成しその活性を検討した。GyrBサブユニットにacrB変異をもつGyrase 〔Gyrase(A+B acrB)と略す〕は野生型〔Gyrase(A+B)と略す〕に対して、スーパーコイリング反応の比活性が、80分の1に低下していた。しかし、各種Gyraseにおいて、アクリフラビンに特異的な感受性は観察されなかった。各種Gyraseの再構成の状態をゲル濾過カラムで解析したところ、Gyrase(A+B acrB)はGyrase(A+B)と同程度の四量体形成が観察された。また、内在するATPase活性には変化がみられなかった。しかし、Gyrase(A+B)と比較して、Gyrase(A+B acrB)はDNA存在下で特異的におこるATPaseの活性化がほとんど観察されなかった。そこで、Gyrase認識配列をもつDNA断片を基質として、ゲルシフトアッセイをおこない、Gyrase(A+B acrB)およびGyrase(A+B)のDNAとの結合の程度を調べたところ、Gyrase(A+B acrB)ではDNA結合能が低下していることが観察された。しかし、アクリフラビンに特異的な感受性は観察されなかった。これらの結果から、acrB変異は大腸菌GyraseのDNA結合能を低下させる変異であること、DNA結合能の低下に由来するGyrase(活性の減少がin vivoでのアクリフラビン感受性をきたしていることを明らかにした。また、gyrB遺伝子のacrB変異が存在する領域(C-TERM領域)はこれまで、GyrAサブユニットとの会合やGyraseのコンフォメーション変化に必要と考えられていたが、さらにGyraseのDNA結合にも関与していることが示唆された。第2章において、Gyraseのキノロン薬耐性変異とacrB変異の関係を調べる実験をおこなった。キノロン薬耐性変異をGyrAサブユニットにもつ大腸菌JM109株よりgyrA96遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果はオリジキシン酸耐性変異株由来のgyrA遺伝子で報告されていた変異(GyrA Asn87)と一致した。さらに、GyrBサブユニットにキノロン薬耐性変異をもつgyrB(Glu447)遺伝子を作成し、acrB変異も併せもつ二重変異遺伝子gyrB(acrB-Glu447)も作成した。これらの遺伝子産物(各サブユニット)をGSTタンパク質融合法により精製し、各サブユニットを再構成させた各種Gyraseを使用したキノロン薬耐性変異とacrB変異の関係について検討した。再構成した各Gyraseのスーパーコイリング活性を調べたところ、キノロン薬耐性変異をもつGyrase(A Asn87+B)およびGyrase(A+B Glu447)は既報どおり、キノロン薬(オキソリン酸)に低い感受性を示した。ところが、意外にもこれらのGyraseはすべてアクリフラビンに高い感受性を示した。アクリフラビンはGyraseのDNA結合を阻害するため、キノロン薬耐性変異も同様にGyraseのDNA結合に関与することが予想された。そこでアクリフラビン存在下で、Gyrase(A+B Glu447)およびGyrase(A+B acrB-Glu447)のDNA結合をゲルシフトアッセイで検討した。その結果、前者はGyrase(A+B)と同程度の結合を示し、後者はアクリフラビン高感受性を示した。また、キノロン薬存在下で、キノロン薬耐性のGyraseもGyrase(A+B)と同程度にDNAと強く結合することを明らかにした。
 これらの結果は、キノロン薬変異は通常観察されるDNA結合とは別のタイプのDNA結合に関与しており、acrB変異によって通常のDNA結合が抑制されたときにのみ、ゲルシフトアッセイで検出されることが示唆される。また、Gyraseはキノロン薬と結合する際に、各GyrA,B,サブユニットのキノロン薬耐性変異領域同士が接近して、`キノロンポケット'と呼ばれる構造を作ることが予想される。以上の経緯は各サブユニットが協調して、DNA結合をおこなう際にできる構造であることを強く示唆した。},
 school = {甲南大学},
 title = {大腸菌DNAジャイレースにおけるacrB変異に関する分子生物学的研究},
 year = {},
 yomi = {フナツキ, ケンゾウ}
}